Introduction générale à la biotechnologie végétale

Préfaces

Ce cours proposé porte sur l’introduction générale à la biotechnologie végétale, décrit les méthodes de la culture in vitro et leurs applications. Il s'adresse donc à tous les étudiants qui font la spécialité de biotechnologie  et de phytotechnie.

Au début de l’agriculture on choisit les graines de façon empirique. Les techniques classiques d'amélioration des plantes reposent sur le croisement des espèces et des variétés, suivies de la sélection de génotypes résistants. Ces méthodes rencontrent des difficultés, telles que les barrières biologiques d'incompatibilité empêchant la reproduction sexuée entre espèces et individus.

Depuis une dizaine d’années on pratique une sélection raisonnée. Les biotechnologies végétales sont des techniques de laboratoire qui permettent l’optimisation et la diversification des végétaux ou de leurs composants. Ces techniques reposent principalement sur les cultures in vitro. Les premiers résultats intéressants de culture de tissus végétaux furent obtenus par Gautheret, Nobecourt et White en 1938. Elles se font hors sol, en conditions stériles et très contrôlées. Les biotechnologies végétales ont plus de cinquante ans. Elles font désormais partie de notre environnement scientifique, quand elles ne sont pas ramenées au simple rang de technique.

Leur développement et leur succès sont le résultat d’une longue histoire expérimentale, mais aussi, pour un large part durant les dernières années la culture des tissus végétaux s’est développée, offrant un ensemble d’outils technologiques au service de la production végétale. Ces techniques (micropropagation) s’utilisent aujourd’hui par exemple pour la propagation par clonage des meilleurs individus, l’obtention de plantes indemnes de virus et de maladies, l’amélioration génétique par culture d’anthères et fusion de protoplastes, ou encore la conservation de ressources phytogénétiques. Ces techniques offriront pour les générations futures une importante alternative aux besoins soutenus de production agricole. Lorsque des variétés améliorées de bon indice sanitaire parviendront effectivement aux producteurs de tous niveaux, on aura contribué positivement à résoudre les problèmes alimentaires d’une population en augmentation constante. 

 

       I.            Généralité

1.1.            Définitions de la biotechnologie

 « Biotechnologie » est un terme relativement récent, puisqu’il est apparu pour la première fois vers 1960. IL est compose de bios (« vie » en grec) et de technologie (entré dans la langue française en 1656, au sens d’« étude des outils, machines et matières premières »). Bien que son étymologie soit assez précise, sa définition est un peu plus vague, en effet, l’application de la science et de la technologie aux organismes vivants pour la production du savoir, biens et services, en est une définition large. Un sens plus restreint du terme « biotechnologie », l’associe aux réalisations des 60 dernières années comprenant toutes les techniques de culture « in vitro » ainsi que les différents aspects de la génétique moléculaire, tels que le clonage de gènes, le séquençage, et aussi la microbiologie, la biochimie, la biophysique, la bioinformatique…

Aujourd’hui, les champs de recherches de la génétique, de la génomique et des biotechnologies concernent aussi bien l’homme que l’animal, le végétale, les microorganismes ou les écosystèmes. Ainsi, les biotechnologies sont à l’origine d’avancées décisives dans différents secteurs comme celui de l’agriculture et l’environnement ou on y trouve la biotechnologie végétale qui étudie les  plantes, et les cultures de tissus végétaux vu leur importance dominante en production d’aliments, de matière première et de médicaments.

1.2.            Les progrès de la Biotechnologie

La biotechnologie au sens large du terme,  est l’utilisation de microorganismes ainsi que des cellules végétales, animales ou humaines pour la production de certaines substances à l’échelle agroalimentaire et industrielle. La biotechnologie végétale étudie les plantes et les cultures de tissus végétaux, vu leur importance en production d’aliments, de matière première et de médicaments. D’autre  part, la culture d’organismes végétaux unicellulaires pour la production de biomasse ou l’extraction de produits de haute valeur ajoutée est une pratique qui augmente de jour en jour, à mesure que se développe la biologie moléculaire. Enfin, les techniques de la culture « in vitro » et la reproduction de plantes modifiées, via les techniques de génie génétique, ont déjà été expérimentées avec succès. Ces technologies permettent de remédier aux carences, d’améliorer les espèces et de mettre en place une résistance aux fléaux et aux maladies de nombreuses espèces végétales.

1.3.            Division des biotechnologies en fonction des domaines d’application

Les biotechnologies peuvent être subdivisées en 5 classes:

1.3.1.      Les biotechnologies blanches

Les biotechnologies blanches consistent en l’emploi de systèmes biologiques (bactéries) pour la fabrication, la transformation ou la dégradation de molécules grâce à des procédés enzymatiques ou de fermentation dans un but industriel

1.3.2.      Les biotechnologies jaunes

Elles concernent l'environnement (biodépollution, bioremédiation, phytoremèdiation, ..)

1.3.3.      Les Biotechnologies rouges

Elles concernent la santé humaine (biomédecine) et animale, la production de médicaments issus d’organismes vivants ou de leurs composants cellulaires. C’est dans cette catégorie que les efforts les plus importants ont été entrepris. On estime qu’en 2010, 80% des nouveaux médicaments seront issus, directement ou indirectement, des biotechnologies modernes (exemple d'application: Biotechnologies et médicaments du futur).

1.3.4.      Les biotechnologies bleues

Elles concernent la vie marine dont la valorisation des matières premières (agarose, alginates, chitine, chitosane,..)

1.3.5.      Les biotechnologies vertes

Elles concernent la valorisation des productions agricoles, l'agroalimentaire. Elles comprennent les techniques de micropropagation et transgénèse végétale ou animale avec lesquelles on obtient des organismes génétiquement modifiés (OGM). Les biotechnologies vertes constituent les biotechnologies les plus anciennes. Les fermentations ont d’abord utilisé des micro-organismes non sélectionnés pour produire de l’alcool, de l’acide acétique, des fromages, etc.

1.4.            Biotechnologies végétales  (Les biotechnologies vertes) 

La biotechnologie végétale est l’intervention humaine sur des végétaux au moyen d’instruments technologiques afin de produire des réactions permanentes transmissibles à la descendance et de mettre au point de nouvelles variétés de plantes en utilisant des cultures « in vitro » pour la multiplication conforme, ou des techniques moléculaires de génie génétique: séquençage, clonage, sélections assistée par des marqueurs moléculaires, transgénèse

1.4.1.      Outils de la biotechnologie végétale  

  Pour atteindre  ses objectives, la biotechnologie végétale a besoin d’outils adéquats pour étudier les végétaux au niveau cellulaire et moléculaire:

1.4.1.1.            La culture « in vitro » 

 visant à régénérer une plante entière à partir de cellules ou de tissus végétaux en milieu nutritif, en s’appuyant sur les propriétés de la cellule végétale qui sont :la plasticité et la totipotences et en utilisant des techniques modernes de culture cellulaires à savoir : la multiplication conforme, culture de méristèmes, culture d’embryons, l’embryogenèse somatique, culture d’haploïdes, cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM) …

1.4.1.2.            Les plantes modèles  

Arabidopsis thaliana, le riz, le colza…, sont des plantes modèles dont le génome a été entièrement séquencé et étudié et qui ont contribué dans l’exploration de génomes plus complexes et plus vastes de plantes cultivées qui constituent des obstacles a leur analyse génétique et moléculaire.

1.4.1.3.            Biologie moléculaire et génie génétique  

L’ensemble des outils et des techniques de la biologie moléculaire permet de manière contrôlée l’étude de la modification des gènes et l’obtention d’organismes génétiquement modifiés (OGM) par transgénèse, et aussi de leur clonage, leur séquençage, leur découpage, en s’appuyant sur différents outils : enzymes de restriction, vecteurs, sondes…

Ainsi que, l’utilisation des marqueurs moléculaires pour identifier et sélectionner précocement les plantes qui possèdent des gènes induisant des caractères souhaités (résistance, qualité,).c’est la sélection assisté par marqueurs (PCR, microsatellites, ISSR, RADP…). 

1.4.1.4.            La bioinformatique  

La bioinformatique  propose d’organiser, de gérer et d’analyser la multitude de données produites par les méthodes de la génomique. Elle a pour mission de 

ü  stocker les données de génomique structurale et fonctionnelle dans de larges bases de données informatiques.

ü  Permettre à tous les biologistes d’y accéder de façon simple et rapide. A partir des données de séquençage, la bioinformatique développe des programmes pour

ü  Annoter les gènes: comparer les séquences d’organismes différents entre elles et prédire la fonction des gènes.

ü  Prédire des éléments: de régulation de l’expression des gènes et de localisation dans la cellule des protéines codées par les gènes. 

1.5.            Objectifs et intérêts de la biotechnologie végétale  

1.5.1.      Participer à l’avancée des connaissances

Les progrès spectaculaires de la biologie moléculaire, de la bioinformatique et de diverses technologies comme le séquençage et l’analyse d’images, ont ouvert un nouveau champ d’investigation du vivant qu’on appelle la génomique qui permet désormais de dresser un catalogue de tous les gènes d’un organisme puis de comprendre leurs fonctions, leur régulations et leurs interactions. Ce programme porte sur le génome de plusieurs plantes : blé, mais, colza,…ou il s’intéresse aux gènes impliqués dans la résistance aux maladies, des caractères agronomiques et les qualités de la récolte.  

1.5.2.      Augmenter la biodiversité 

L'intégration de nouveaux caractères peut se faire, soit par des méthodes de sélection conventionnelle intégrant les nouvelles connaissances sur le génome, soit par transgénèse (OGM) lorsque la diversité génétique d'une espèce n'offre pas de possibilités d’amélioration. Quelle que soit la voie choisie, la génomique participe donc à l’enrichissement de la biodiversité 

1.5.3.      Contribuer à un meilleur environnement

 Exemple : les programmes de résistance du maïs à la sécheresse. L’eau est une ressource limitée dont l’agriculture est la première utilisatrice, devant l’industrie et la consommation humaine. Pour la culture du maïs, qui exprime des besoins en eau importants, une façon de mieux gérer l’eau consiste donc à créer des variétés qui tolèrent une disponibilité réduite en eau, sans que leurs capacités de production n’en soient affectées, cela grâce à l’introduction par transgénèse d’un gène de sorgho, céréale.

1.5.4.      Améliorer la qualité sanitaire des aliments

 Exemple : les blés et maïs résistants aux champignons parasites : Toutes les plantes, sauvages ou cultivées, sont sensibles à des champignons parasites qui les attaquent aux différents stades de leur développement, mais aussi après la récolte. Les pertes induites par l’action de ces derniers  sont considérables. Des recherches en biotechnologie végétale permettront d’améliorer la résistance du blé et du maïs à certains champignons parasites.

1.6.            La place des biotechnologies dans l’amélioration des plantes

Les biotechnologies peuvent intervenir à différents niveaux dans un programme de sélection :        

1.6.1.      Exploiter la diversité.

Il s'agit, pour le sélectionneur, d'accroître les possibilités de choix des parents à l'origine du croisement de départ. Les techniques de biologie cellulaire, sauvetage d'embryons et fusion de protoplastes, parce qu'elles permettent de s'affranchir des contraintes de la reproduction sexuée, constituent une aide largement utilisée, tout comme la transgénèse.

1.6.2.      Connaître le génome

 Les techniques de marquage moléculaire permettent de rendre plus précises et plus rapides les opérations classiques de sélection. Elles interviennent à chaque étape du cycle de sélection. Les outils mis en place sont les marqueurs moléculaires qui permettent l'analyse des individus, la construction de cartes génétiques pour localiser les gènes sur les chromosomes, la sélection assistée par marqueurs pour suivre les gènes au cours des générations. La recherche des gènes intervenants peut ainsi être facilitée et leur isolement est réalisé grâce à la génomique. 

1.6.3.      Diminuer la durée de création

Les gains de temps peuvent être réalisés de deux façons : soit en fixant plus rapidement le matériel génétique, pour l'obtention de lignées, soit en augmentant le nombre de générations par an. Les techniques mises en jeu font alors appel à la culture in vitro de gamètes ou haplodiploïdisation et à la culture d'embryons immatures.

1.7.            Aspects historiques du développement des cultures in vitro

Ø  1934 : Identification de l’acide indole acétique (IAA) par Kogl 1934 : Gautheret échoue dans la culture de cambium de ligneux

Ø  1935 : White réussit la culture de racines de tomates

Ø  1939 : Gautheret cultive du cambium de carotte et de tabac (utilisation d’auxine) 1941 : le lait de coco dans la composition du milieu de culture in vitro de Datura

Ø  1943-1950 : Travaux sur l’agent bactérien de la galle du collet 1949 : Culture in vitro de fruits (Nitsch)

Ø  1951 : Culture d’ovaires (Nitsch)

Ø  1951 : Contrôle chimique de la croissance et de la formation d’organes (Skoog)

Ø  1952 : Microbouturage

Ø  1952 : Culture d’embryons de Dahlia virosés

Ø  1953: Cal haploïde à partir de pollen

Ø  1954 : Cal à partir d’une cellule unique (Muir)

Ø  1955 : Identification de la kinétine (une cytokinine)

Ø  1956 : brevet sur la production de substances à partir de cultures de tissus végétaux (Phaseolus) par Routien JB et Nickell LG

Ø  1956 : premières cultures de suspensions cellulaires

Ø  1957: Skoog et Miller établissent le cadre théorique de l’influence de la balance hormonale auxine/cytokinine sur l’organogenèse

Ø  1957: culture d’anthères excisées

Ø  1958: cultures d’ovules de pavot

Ø  1958 : embryogenèse somatique

Ø  1960 : préparation de protoplastes par digestion enzymatique

Ø  1964 : génération artificielle d’individus haploïdes de Datura

Ø  1965 : Vasil et Hildebrandt régénèrent un plant de tabac à partir d’une cellule isolée

Ø  1970 : Fusion de protoplastes 

Ø  1977 : Réacteur de 20 000 Litre  pour la culture de tabac

Ø  1978 : production à l’échelle industrielle de shikonine rendue possible par la sélection de lignées cellulaires fortement productrices (Tabata M)

Ø  1979 : Utilisation de l’inclusion de cellules dans des billes d’alginates pour la biotransformation  1982 : transformation de protoplastes par de l’ADN nu

Ø  1983 : Mitsui Petrochemicals produit de la shikonine avec des réacteurs de cellules Lithospermum  1984 : Transformation de protoplastes de tabac et régénération d’un plant transformé (Paszowsky) 1984 : Agrotransformation de disques folliaires (Horsch)

Ø  1984 : Electroporation

Ø  1987 : Canon à particules

Ø  1991 : cryopreservation de lignées cellulaires de Catharantus

Ø  1994 : Premier OGM végétal commercialisé : La variété de tomates Flavr Savr  inventée et commercialisée par la société CALGENE (échec commercial)

Ø  1996 : Premier maïs transgénique commercialisé aux USA

    II.            Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes

2.1.            Multiplication végétative et reproduction sexuée

Le remplacement des individus éliminés par la mort, caractéristique fondamentale des êtres vivants, se réalise selon deux modalités principales qui s’opposent par de nombreuses caractéristiques : la reproduction sexuée et la multiplication végétative.

Il n’y a pas de reproduction sexuée sans méiose (aboutissant à la production de gamètes à n chromosomes) tandis que la multiplication végétative fait seulement intervenir la mitose. La multiplication végétative se caractérise par la propagation d’individus génétiquement identiques à la plante-mère, aboutissant ainsi à la constitution de clones homogènes.

La reproduction sexuée est caractérisée par la fécondation. C’est une véritable « reproduction », production d’un zygote à 2n chromosomes par fusion de deux gamètes qui aboutit à la formation d’individus réellement nouveaux, puisque leur constitution génotypique est différente de celle des parents (sauf dans le cas ou ceux-ci appartiendraient à une « lignée pure »). 

La reproduction sexuée permet les recombinaisons de gènes. C’est donc une source de variabilité, facilitant l’adaptation et la survie de l’espèce lorsque changent les conditions de l’environnement. A long terme, c’est certainement le mode de propagation le plus efficace pour assurer la survie éventuellement l’évolution de l’espèce. Elle demeure pour le sélectionneur l’outil essentiel.

A l’inverse de la reproduction sexuée, la multiplication végétative assure la stabilité puisque tous les individus d’un clone sont identique, dans la mesure toutefois ou ne surviennent ni mutation ni « variation ».

2.2.            Multiplication végétative traditionnelle

La méthode la plus simple, la division de souches, implique en effet la formation par la plante-mère, avant la séparation, d’un assez grand nombre de bourgeons axillaires ou adventifs déjà enracinés ou apte à la rhizogenèse. Elle exploite donc une préadaptation à la multiplication végétative spontanée.

2.2.1.      Le marcottage 

Consiste à induire la rhizogenèse avant la séparation. Remarquons que certaines espèces (comme le Framboisier) se marcottent spontanément  et se bouturent mal, ce qui suggère le rôle essentiel dans la rhizogenèse des inter-relations entre les organes de plante-mère.

2.2.2.      Le bouturage 

Implique à l’inverse la séparation de la bouture avant son enracinement. Lorsque la bouture possède un ou plusieurs bourgeons le principal problème d’organogenèse posé par le bouturage est la rhizogenèse. Lorsqu’il s’agit d’un fragment de tige ou de racine dépourvu de bourgeons, la bouture doit produire à la fois des méristèmes de tige et de racine, l’ordre d’apparition des deux sortes de méristèmes variant avec l’espèce.

2.2.3.      Le greffage 

Est un cas très particulier de multiplication végétative. Il permet en effet de multiplier le clone auquel appartiennent les greffons. Mais il existe un support végétal, le porte-greffe, provenant lui-même de semis, généralement.

2.3.            La méthode « In vitro »

Une plante est un organisme multicellulaire résultant de divisions du zygote initial par mitoses successives. Chaque cellule de la plante contient donc la même information génétique. Cependant en examinant les différents niveaux d’organisation de la plante, on observe une grande diversité de formes cellulaires, celles-ci se structurant sous  forme de tissus et d’organe pour développer des fonctions spécifiques dans un individu complet. La spécialisation est le point de départ d’un système complexe et interdépendant entre ses unités constitutives. Ainsi les cellules des racines sont spécialisées dans l’absorption et le transport de substances nutritives tandis que les cellules de feuilles ont la forme, la structure de la fonction nécessaire pour transformer l’énergie lumineuse en énergie chimique. Si la communication entre les différentes parties du système est interrompue, de fortes altérations se produisent dans le fonctionnement de l’ensemble.

C’est probablement pour cela qu’une cellule ou un morceau de tissu séparé de la plante ne seront pas capable de croitre et de se développer dans un milieu à composition chimique relativement simple alors que la plante complète n’aura pas de problème pour s’y développer. Pour la culture de matériel végétal séparé de la plante il faut ajouter au milieu synthétique toutes les substances nutritives, vitamines et régulateurs de croissance que les cellules, les tissus et les organes auraient reçue à travers les racines ou les organes photosynthétiques de la plante.

2.3.1.      Principes fondamentaux 

Lorsqu’on cultive des cellules, tissus ou organe in vitro, il faut prendre en compte quelques principes fondamentaux. Il faut tout d’abord choisir le matériel que l’on veut cultiver puis le prélever de la plante. On doit ensuite éliminer les microorganismes qui contaminent le matériel végétal. Enfin il faut fournir aux cellules, tissus et organes des conditions ambiantes appropriées en leur procurant un milieu de culture synthétique et des conditions d’incubation adéquates. L’asepsie et l’inoculation du matériel végétal doivent être réalisées en milieu ambiant stérile.

Les cultures in vitro peuvent être initiées à partir de presque toutes les parties de la plante. Cependant la source originale du matériel végétal peut déterminer le succès de la mise en place de la culture. Il est conseillé de comparer systématiquement les différentes sources de cellules, de tissus ou d’organes avant d’en choisir une. Généralement on recommande d’utiliser des plantes saines et vigoureuses comme source d’explants.  

Le type de plante est déterminant pour le succès de la culture in vitro ; par exemple les tissus par le type de matériel végétal employé on peut classer les cultures in vitro en : 

ü  culture d’organe ; 

ü  culture de tissus ; 

ü  culture de cellules en suspension ; 

ü  culture de protoplastes.

 L’appellation générale « culture de tissus » est utilisée pour faire référence à toutes ces modalités.

2.3.2.      Bases biologiques de la culture in vitro 

2.3.2.1.            La multiplication 

La croissance des plantes se fait en plusieurs étapes qui permettent le développement d'une graine en une plante capable de se reproduire. Pour cela, il faut d'abord une prolifération cellulaire par mitose qui se réalise au niveau de tissus spécialisés : les méristèmes (= zone de prolifération cellulaire). Ils sont situés :

ü  méristèmes primaires: apex des racines, extrémité des tiges, bourgeons apicaux, 

ü  méristèmes secondaires: dans les tissus plus anciens responsables de l'épaississement des tissus. Une fois la croissance réalisée, il y a différenciation de cellules qui serviront les unes à la circulation des sèves (phloème, xylème), les autres à la photosynthèse (feuilles), à la nutrition (racines). C'est donc un phénomène complexe qui dépend de facteurs externes et internes. 

2.3.2.2.            Les substances de croissance (Les phytohormones) 

Le développement végétal est régulé par des facteurs de croissance qui, par leur action à distance du lieu de production sont appelés PHYTOHORMONES. Ces substances peuvent agir en synergie ou en antagonisme. 

Les hormones végétales ou phytohormones sont impliquées à tous les stades de la vie d'une plante depuis la pollinisation provoquant la fécondation et le développement de l'embryon zygotique, tout au long du développement de celui-ci en plante adulte jusqu'au contrôle de la floraison, de la fructification et de la sénescence. Les mêmes phytohormones ne font pas que diriger les processus de croissance et de développement: elles sont pour cela obligatoirement impliquées dans des mécanismes spécifiques de division, d'élongation et de différenciation cellulaire, mais aussi nécessairement dans les métabolismes primaire et secondaire.

Les phytohormones sont d'une importance capitale dans le contrôle des cultures in vitro de cellules, tissus, organes ou plantes entières, c'est-à-dire dans l'orientation qu'on veut leur donner : maintien en vie, croissance, initiation d'une organogenèse spécifique (production d'organes tels que pousses feuillées, racines, embryons somatiques*), multiplication d'organes ou de plantules, etc… Elles sont également largement utilisées pour le contrôle de la production de métabolites secondaires d'intérêts divers.

2.3.2.3.            La totipotence cellulaire

Une cellule est dite totipotente quand elle a la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule spécialisée et de se structurer en formant un organisme pluricellulaire. En effet, les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation : les cellules peuvent redevenir des cellules simples, non spécialisées et se différencier ensuite pour donner à nouveau les différents types de cellules spécialisées. Grâce à la totipotence, l’arbre et d'autres plantes, mis en milieu stérile, sont techniquement immortels.

La totipotence débute par la formation de cals : amas de cellules indifférenciées qui permet de régénérer un individu entier génétiquement identique à la plante mère. Pour cela, il faut que les explants soient placés dans des conditions appropriées.

 

 III.            Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro

 La culture in vitro ou culture de tissus se définit comme l'ensemble des techniques qui permettent de faire croître en milieu artificiel (en éprouvette) des cellules spécialisés, ce qui représente une grande variété de tissus.   

Par opposition à la culture en terre ou dans des substrats imbibés de solution nutritive, la culture in vitro se fait en laboratoire à l’abri de toute contamination cryptogamique, dans des récipients qui peuvent être tant des tubes à essai que des bocaux à conserve. Ces récipients sont placés dans un endroit où l'intensité de la lumière, la durée de l'illumination, la température et l'hygrométrie sont constamment contrôlées.   

Afin de mieux comprendre la culture in vitro des tissus végétaux, il faut posséder quelques notions sur la reproduction des végétaux. La reproduction chez les végétaux peut se faire de 2 manières :

ü  la multiplication sexuée, à l'aide d'échanges génétiques : gamètes mâles X gamètes femelles = graine

ü  la multiplication asexuée comme par bouturage où un seul petit fragment de tige ou de feuille peut redonner après développement, une plante entière. C'est précisément ce type de multiplication végétative qui est mis en pratique dans la culture in vitro de manière accéléré à l'abri de toutes contaminations par des bactéries ou par des champignons.   

La culture in vitro végétale est possible parce que les cellules végétales présentent la potentialité de reproduire des individus complets identiques à la plante sur laquelle les cellules ont été prélevées. Cette propriété a été baptisée «totipotence cellulaire». La cellule animale présente aussi cette capacité mais à un degré moindre. Toutes les cellules d'un même organisme renferment dans leur noyau exactement les mêmes chromosomes, l’information génétique pour reconstruire l’organisme entier. Ce message héréditaire représente toutes les potentialités de l'individu. Cependant, à un moment donné de la vie embryonnaire, un choix va se faire, dans un groupe de cellules données, destiné à former un organe ayant une forme et une fonction précise. Une grande partie du message héréditaire va être mise en sommeil, dans un autre groupe, destiné à une autre fonction, c'est une autre partie du message qui sera occultée.   

Le développement à partir d'une cellule simple va se faire par de nombreuses divisions cellulaires (mitose) et par le blocage ou le déblocage de certains gènes, les cellules orienteront leur développement vers une voie particulière qui formera soit un tissu, soit un organe ou autres éléments nécessaires à la future plante. 

Ce sont des inhibitions sélectives qui provoquent la différenciation entre les cellules et leur spécialisation. Toutes les cellules contiennent en puissance la totalité de l'organisme, mais elles n'en expriment qu'une partie. Cependant, contrairement aux cellules humaines ou animales, certaines cellules végétales ont le don de se déspécialiser et de redevenir capables d'engendrer un organisme entier. C'est précisément cette faculté que l'on exploite dans la propagation in vitro de plusieurs plantes. Les cellules végétales appartiennent à des tissus très spécialisés qui possèdent la possibilité de se déspécialiser, formation d'un CAL, et redevenir capables d'engendrer une plante entière en recommençant tout le processus de spécialisation (blocage et déblocage).   

Afin de réaliser la culture in vitro de tissus végétaux, il est important de respecter les étapes de mêmes que les différentes conditions nécessaires, le choix de l’explant et le milieu de culture.

3.1.            L'explant 

 Un « explant » est le matériel végétal de base qui servira à produire des clones végétaux à partir d'une « plante-mère » ou éventuellement secondairement des greffons.

 Ce sont des parties d'organes ou  un organe entier, tissus, pièces florales, graines ou embryons, bourgeons ou apex ou méristèmes, cellules somatiques ou sexuelles, protoplastes.

En d’autre termes, l’’explant est une petite partie ou fragment du plante-mère, qui est mis en culture dans l’éprouvette. L'état sanitaire de cette plante conditionne la nature de l'explant.  

ü  Si le plant-mère est malade, virosée, alors il faudra prélever un explant constitué de cellules méristématiques. Ce type d'explant est appelé indifférencier.   

ü  Si le plant-mère est en santé, alors d'autres types d'explant pourront être prélevés, c’est explants sont appelés différenciés.   

Cependant, il est important de noter que d'autres facteurs vont conditionner les réactions de l'explant, l'âge ou le stade physiologique du plant-mère, la structure, la taille et l'emplacement de l'explant lui-même. En effet, des explants différents prélevés sur une même plante donnent des résultats différents sur un milieu identique.   

L’explant peut être prélevé sur n'importe quelle partie du plant-mère à condition de renfermer des tissus vivants et de tenir compte de l’état du plant. Il y a plusieurs sortes d'explants : 

ü  Les explants indifférenciés sont prélevés à l’apex de tige, de racine, de bourgeons, de nœuds,   

ü  Les explants différenciés sont prélevés sur la tige, la feuille, la racine. Ces explants sont des structures constituées de cellules très spécialisées qui devront se déspécialiser avant de pouvoir régénérer la plante entière.

3.2.            Le milieu de culture 

 Le milieu de culture est important pour la croissance. Il est le plus souvent une solution aqueuse rendue semi-solide ou moyen de gélose (agar). Remplaçant le sol et suppléant la plante, il doit contenir différents éléments. Très généralement il est composé d’une base comprenant des sucres (énergie), des éléments minéraux divers, des régulateurs de croissance, des vitamines, des composés organiques (acides aminés, polypeptides, …). 

La concentration de ces composés peut varier d'une espèce à l'autre, mais ces variations n'ont qu'une incidence faible sur les réactions des cellules. Les facteurs essentiels sont les régulateurs de croissance qui stimuleront la multiplication cellulaire et orienteront la morphogenèse.   

Dans le milieu de culture, on retrouve des substances qui sont :

ü  soit endogènes, c’est-à-dire qu’elles sont produits par la plante ;   

ü  soit exogènes, c’est-à-dire des substances de synthèse ou artificiel mais dont l'effet est similaire.   

3.3.            Les principales substances (régulateur de croissance) 

Utilisées pour la culture in vitro sont les auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Leurs effets varient avec les concentrations utilisées et le dosage, à doses élevés, ils peuvent se montrer inhibiteurs ou toxiques. (Figure)  

Dans la famille des auxines, on retrouve l’acide indolyocétique (AIA) et les substances de synthèse à action analogue comme l'acide naphtylacétique (ANA), l'acide indolybutyrique (AIB) ou l'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4D). Ces substances possèdent de nombreuses propriétés.

ü  Activent la multiplication cellulaire (mitose) ;

ü  Amènent la formation de racines (rhizogénèse) ;

ü  Stimulent le métabolisme.  

Dans la famille des cytokinines, certaines sont des composés endogènes comme la zéatine et l'isopentényladénine (IPA), ou de synthèse comme la benzyladénine (BA) ou la kinétine. 

ü  Agissent en synergie avec les auxines avec un effet stimulant sur le métabolisme et sur la division cellulaire. Si de fortes concentrations de cytokinines sont combinées à des concentrations plus faibles d'auxines, les cytokinines ; 

ü  Agissent en synergie avec les auxines ; 

ü  Activent la multiplication cellulaire (mitose) avec la formation d'un cal.  

Dans la famille des Gibbérellines on retrouve que des substances endogènes. La plus utilisée est l'acide gibbérellique (GA3). Les gibbérellines seront utiles dans les cas ou seule la croissance est souhaitée. 

ü  Stimulent l'élongation cellulaire et la multiplication cellulaire ; 

ü  Elles peuvent rendre les cellules plus sensibles à l'action des auxines.   

Comportements des deux grands types d'explants dans le milieu de culture .

Pour les explants indifférenciés, lorsqu’ils sont disposés sur le milieu approprié, on observe rapidement une cicatrisation de la blessure. Il se produit alors la différenciation ou la spécialisation. Par la suite, plusieurs modalités sont possibles :

ü  la plus simple, (œillet ou chrysanthème) un seul milieu contenant une auxine et une gibbérelline suffira pour assurer la croissance de la jeune plante jusqu'au stade d'acclimatation. Dans ce cas, l’auxine et la gibbérelline assurent la croissance de la jeune tige qui émettra ensuite des racines.   

ü  la plus complexe, (rosier ou pommier) une succession de milieux est nécessaire pour assurer les différentes étapes de la morphogenèse.   

Pour les explants différenciés, ils doivent effectuer un retour à l'état méristématique. Après le repiquage on observe la formation du tissu cicatriciel (le cal), qui procédé la multiplication cellulaire. Il se produit la dédifférenciation ou la déspécialisation qui sera suivit d'une différenciation ou d'une spécialisation. Si cette phase se réalise, plusieurs voies sont possibles selon les espèces. 

ü  la première est la voie de la callogenèse dans laquelle les cellules se multiplient activement, forment un massif globuleux et sont plus ou moins fortement liés. Ce stade qui constitue la première étape du retour peut être le seul atteint, ensuite, quel que soit le milieu, il n'est pas possible d'obtenir de néoformations de bourgeons. Quelquefois cette phase est un préalable à l'organogenèse.  

ü  la seconde voie qui parcourt toutes les étapes et conduit à l’état méristématique soit à partir du cal ou de certaines cellules épidermiques. 

ü  la troisième voie est celle qui conduit à la formation d'embryons somatiques (les clones). Elle peut se produire après la formation d'un cal ou bien directement à partir de quelques cellules ou de cellules isolés. Les embryons somatiques mis en culture sur un milieu de croissance redonnent une plantule identique au pied-mère. 

Dans ce type d'explant, il faut noter que le comportement est conditionné par d'autres facteurs comme l'âge du plant-mère, les dimensions de l'explant, la manière de placer l'explant dans le milieu de culture, l'exposition du plant-mère à la lumière, …

 

 IV.            Besoins nutritifs et environnementaux des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques

Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un programme d’évolution déterminé. 

Premier élément : toutes les cellules du végétal n’ont pas les mêmes potentialités au cours du développement. Certaines se spécialisent et se différencient et perdent leur possibilité de se diviser. D’autres forment des plages de cellules indifférenciées qui forment les méristèmes et qui se divisent activement. Ce sont des zones à l’origine de la croissance (en largeur ou en longueur) des plantes. 

Deuxième élément : des régulateurs de croissance ont été identifiés. Ils affectent la vitesse de croissance des cellules et leur différenciation, et sont impliqués dans les corrélations entre organes. La découverte de ces substances (auxines, gibbérellines, cytoquinines, acide abscissique, éthylène, oligosaccharines) a permis le développement des techniques de culture in vitro. 

D’autres facteurs interviennent et notamment le choix de l’explant, dont dépend la totipotence des cellules prélevées. Ces mécanismes de « vieillissement » sont dus à des modifications de la structure des méristèmes. Pour donner un exemple on peut citer l’aptitude au bouturage qui décroît lorsque l’âge des pieds-mères augmente. Mais la perte liée à l’âge ne se retrouve pas de façon égale au niveau des différentes parties de la plante, la partie racinaire de la plante constituant souvent le pôle de juvénilité de la plante. Idem pour la période de l’année dans laquelle on se situe : réapparition d’un fonctionnement de type juvénile au début de chaque poussée annuelle, ou même de chaque réitération. Ou encore « retour en arrière » lors de la floraison : c’est la régénération plus ou moins complète du potentiel morphogénétique initial, et celle-ci précède la différenciation des organes floraux. On pourra donc intervenir sur la qualité de l’explant : en fonction de l’âge du pied-mère, en fonction de l’époque de prélèvement, en fonction de sa localisation sur le pied-mère, en fonction aussi de sa taille et de sa nature.

4.1.            Les sels minéraux 

Les besoins nutritifs des plantes en culture in vitro concernent d’abord les sels minéraux. Le praticien doit avant toute chose recréer pour la plante un milieu de vie comparable au sol dont elle sera maintenant dépourvue. Tous les éléments essentiels à sa croissance doivent donc être incorporés au milieu sans quoi une carence minérale peut survenir. De plus, le choix des différents sels devra respecter un équilibre ionique afin de favoriser une croissance harmonieuse sans créer d’inhibition. Les besoins des cultures de tissus en éléments minéraux ont été étudiés par différents auteurs et le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes compositions minérales toujours utilisées aujourd’hui. Ces formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels que GAMBORG (Canada), GAUTHERET (France), HELLER (France), MURASHIGE et SKOOG (Etats-Unis), WHITE (Etats-Unis), MOREL (France), etc.  La composition du milieu de culture Murashige et Skoog est sans doute la plus utilisée car elle convient à un très grand nombre de plantes de familles botaniques différentes. Ce milieu est très riche en sels minéraux et il convient souvent de le diluer de moitié ou plus afin d’éviter des effets osmotiques inhibiteurs, particulièrement chez les espèces à croissance très lente. 

4.1.1.      Milieu de Murashige et Skoog (Tableau 1)

Le milieu de Murashige et Skoog (ou Milieu MS ou MSO) est un milieu de culture utilisé dans les laboratoires debiologie végétale pour la culture de cellules ou de tissus de plantes. Le  milieu MS a été mis au point par les physiologistes végétalistes Toshio Murashige et Folke K Skoog alors que Murashige effectuait des recherches pour trouver un nouveau régulateur de  croissance chez le tabac.

   

Tableau 1 : Milieu MS (Murashige et Skoog) 1962

Constituant	Solution mère (mg par litre)	Volume à ajouter (ml par litre)	Concentration finale (mg par litre)
Macro-éléments 20X		50 ml
NH4NO3	33 000		1 650
KNO3	38 000		1 900
CaCl2-2 H2O	8 800		440
MgSO4-7 H2O	7 400		370
KH2PO4	3 400		170
Micro-éléments 100X		10 ml
MnSO4- H2O	2 230		22.3
ZnSO4-7 H2O	860		8.6
H3BO3	620		6.2
KI	83		0.83
Na2MoO4 -2 H2O	25		0.25
CuSO4 -5 H2O	2.5		0.025
CoCl2 -6 H2O	2.5		0.025
Fer 100 X		10 ml
Na2EDTA	3 730		37.3
FeSO4-7 H2O	2 780		27.8
Acides aminée et vitamines 10 X		10 ml
Glycine	20 mg pour 100 L		2.0
Ac. Nicotinique	5 mg pour 100 L  .1		0.5
Pyridoxine – HCl	5 mg pour 100 L		0.5
Thiamine – HCl	1 mg pour 100 L		0.1
Sucres
Myo-inositol			100
Sucrose			30 000
Agar			10 000

 

Les vitamines

Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la plante est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui-même) de vitamines risque d’être insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence. Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la biotine, le pantothénate de calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considéré comme un sucre). Les concentrations sont souvent faibles et il sera alors nécessaire de fabriquer des solutions-mères. La conservation de ces solutions-mères pourra se faire au congélateur en contenants de plastique ou distribuées dans des cubes à glaçon par petits volumes (exemple 10 ml), puis démoulés une fois gelés et rangés dans des sacs à congélation. Une fois la solution sortie et décongelée, elle devra être utilisée dans les 2 à 4 semaines qui suivent. 

4.2.            Les régulateurs de croissance 

On les appelle aussi « phytohormones » ou « hormones végétales », mais considérant qu’il s’agit variablement de produits de synthèse ou de produits synthétiques, il est préférable d’utiliser le terme régulateur de croissance. Ces substances sont utilisées à des doses très faibles (0.01mg/l à 10 mg/l) et nécessitent le plus souvent d’être pesées sur une balance de précision à 0.0001g. Il est toutefois possible de fabriquer des solutions-mères à partir de masses s’élevant à 100 mg et d’opérer par la suite une série de dilutions. Les trois principaux groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les AUXINES, les CYTOKININES et les GIBBERELLINES.  

4.3.            L’environnement

4.3.1.      La lumière 

Besoin de lumière Chez les plantes cultivées in vitro, la photosynthèse n'est pas une activité nécessaire puisque l'énergie est fournie par les glucides du milieu. Cependant, même réduite la photosynthèse persiste dans les tissus. De plus la lumière est indispensable au déclenchement et au bon déroulement de certains processus morphogénétiques : nécessité de jours longs pour obtenir des boutons floraux par ex. La puissance lumineuse à fournir dépend de la durée de l'éclairement et de la qualité spectrale de la lumière reçue par la culture. On exprime l'intensité lumineuse en W.m-2, intensité mesurée au niveau de la culture. On obtient généralement 100 à 150 W.m-2 pour des tubes fluorescents placés à 20cm au-dessus des récipients de culture.

4.3.2.      Rôle de la température 

La température est généralement régulée à 20/25°C en continu. Il ne faut pas négliger que la température dans les flacons de cultures peut être supérieure de 2 à 4°C à la température de la pièce à cause de l'éclairage.

4.3.3.      Hygrométrie

Elle doit atteindre les 100% d'humidité relative dans les flacons. Cependant, il faut veiller à ne pas noyer les explants par un excès de condensation à la surface du milieu.

4.3.4.      Stérilité 

Le propre de la culture végétale est qu'il s'écoule un laps de temps important entre les repiquages (jusqu'à 3 mois). Comme les milieux sont riches et les conditions de cultures chaudes et humides, toutes les conditions d'un développement bactérien ou fongique sont réunies. Les causes d'infection sont nombreuses. Il faut donc manipuler dans des conditions d'asepsie rigoureuses : - matériels passés à l'alcool ou flambés, - désinfection des plantes à la Javel puis rinçage à l'eau distillée avant l'extraction de l'explant.

 

 

    V.            Technologie de la culture in vitro 

5.1.            Les étapes et les techniques de la culture in vitro 

Les cultures in vitro de plantes sont des cultures d'explants de plantes, sur un milieu nutritif artificiel, en conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans un espace réduit. C'est donc, une méthode pour maintenir et cultiver indéfiniment des plantes ou des cellules sur des milieux nutritifs artificiels. Les explants peuvent être des parties d'organes ou des organes entiers, (tige, feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus, des pièces florales, des graines ou des embryons, des bourgeons ou des apex ou des méristèmes, des cellules somatiques ou sexuelles, des cellules végétales débarrassées de la paroi ou protoplastes. L'explant est choisi en fonction de la technique utilisée, de l'objectif visé, mais aussi de l'espèce travaillée.

Les techniques de culture in vitro, outre l’aspect technologique, doivent permettre de pallier un certain nombre de difficultés : 

ü  maintenir l’explant en vie et en activité ; 

ü  permettre à cet explant d’entrer normalement en croissance si il est déjà une structure organisée (apex, méristème, bourgeon) ;

ü  induire chez des cellules différenciées (fragment de feuilles, de racines, de tiges, de pétioles, etc.) un processus de dédifférenciation.

 La composition du milieu de culture est l’élément déterminant de la réussite de la multiplication végétative in vitro. Les différents éléments composant un milieu de culture idéal sont les suivants : eau, sels minéraux (macroéléments et micro éléments), fer chélaté, vitamines (généralement du groupe B), phytohormones (ou régulateurs de croissance), la source carbonée (généralement du saccharose), et l’agent gélifiant pour les milieux solides; le milieu le plus utilisé dans le monde actuellement est celui de Murashige et Skoog baptisé milieu MS. Le milieu synthétique sera renouvelé toutes les 4 à 5 semaines pour une croissance optimale des vitroplants. Les conditions stériles ou d'asepsie sont obtenues par un ensemble d’opérations qui permettent de protéger l’explant à multiplier et son milieu contre toute contamination microbienne.

 Les explants sont désinfectés, les milieux et les récipients stérilisés à l'autoclave et les opérations de mise en culture se font sous hotte à flux laminaire. Le contrôle de l'environnement de culture des explants se fait par le contrôle des conditions de température, d'éclairement (durée et intensité) et d'humidité relative.

L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées, cultivées dans des récipients posés sur des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité de replanter des hectares de terrain à partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés. Toutes les étapes de développement des plantes peuvent être reproduites in vitro; c'est le cas par exemple de la tubérisation.

5.2.            Les étapes de la culture in vitro

Quatre étapes principales sont nécessaires pour établir une espèce, un cultivar, une variété in vitro. 

Une première étape d'initiation de la culture est nécessaire : c'est la phase la plus sensible qui consiste à désinfecter les boutures (racine, bourgeon, etc.) ou les graines afin de les rendre stériles, avant de les placer sur un milieu de culture approprié. Viennent ensuite les étapes de multiplication, d'enracinement et enfin de sevrage ou acclimatation. Le sevrage est le passage des conditions de laboratoire aux conditions de serre. Cette phase s'avère souvent critique, car les plantes en tubes ont perpétuellement leurs stomates ouverts, même les plantes succulentes peuvent sécher si le changement d'environnement se fait trop brusquement.

Les techniques de culture in vitro sont des outils qui vont aider l'obtenteur de plantes à différents niveaux de son programme d'amélioration, notamment pour réduire les délais de production des nouveaux cultivars, mais aussi pour assainir les variétés, les améliorer, les conserver et réduire les coûts de production. Elles sont multiples et se classent en deux groupes; celles qui vont aboutir à une multiplication conforme: micropropagation, embryogenèse somatique, culture de méristèmes etc., celles qui vont aboutir à une création de variabilité : mutagenèse, variations somaclonales, transgenèse etc.

5.2.1.      Les phases de la micropropagation 

Voici globalement les cinq stades de la micropropagation: 

1)      Conditionnement du plant mère;

2)      Établissement (ou initiation) d’une culture aseptique; 

3)      Multiplication des tiges; 

4)      Rhizogénèse (ou enracinement des tiges); 

5)      Acclimatation des plantules.

5.2.1.1.            Stade 1 : Conditionnement des plants mères  

Dans la description de cette technique on passe souvent sous silence le stade 1 qui contribue pourtant pour beaucoup au succès des stades suivants. Ce stade 1 réfère au conditionnement du plant mère. En effet, le plant mère devrait être dépourvu de carences minérales et en pleine turgescence donc sans stress hydrique important. Au mieux et dans presque tous les cas, le plant devrait être en croissance active, donc mis en culture en dehors de sa période de dormance. Ceci limite dans le calendrier de production, les dates préférables de mises en culture pour le stade d’initiation. Mais, une fois in vitro, ces plants pourront être multipliés à l’année longue. Aussi les plants mère choisis le seront en fonction de leur état sanitaire. Des plants infestés d’insectes peuvent apporter des problèmes de taille à toute une chambre de culture. 

5.2.1.2.            Stade 2 : Établissement d’une culture aseptique 

 La littérature fournie souvent les premières informations essentielles au départ d’une culture. On trouve dans les livres ou revues spécialisés le détail des formulations (recettes) de milieux nutritifs convenant à de très nombreuses espèces végétales. Généralement les auteurs précisent aussi le protocole de désinfection de surface des explants ainsi qu’une description de l’explant mis en culture. Ce stade est de première importance puisqu’il comporte de nombreux facteurs critiques : Le choix du plant mère; Le choix du fragment végétal à mettre en culture; Une stérilisation de surface adéquate garantissant la survie de l’explant tout en assurant l’asepsie; · La découpe de l’explant et sa position sur la gélose; Le choix du milieu de culture qu’il est parfois nécessaire d’ajuster légèrement par la suite suivant la réponse de l’explant; · La qualité du travail en asepsie de la technicienne ou du technicien. Dans plus de 50 % des cas, les premiers essais de mise en culture sont très satisfaisants et demandent très peu ou pas d’ajustements. Pour certains autres cas, la difficulté réside dans la désinfection des végétaux, pour d’autres dans l’ajustement de l’équilibre hormonal. Mais selon tous les auteurs, théoriquement tous les végétaux quels que soient leur espèce ou leur cultivar, peuvent être cultivés in vitro. Les explants les plus aptes à entreprendre une multiplication sont généralement riches en bourgeons ou en zones méristématiques potentielles. Ils varient selon les espèces : 

ü  Les feuilles (ex. Ficus, Saintpaulia, Bégonia…); 

ü  Les tiges (asperge, colza…); 

ü  Les bourgeons (fraisier, vigne, lilas,…); 

ü  Inflorescences (chou-fleur, gerbera, hosta, poireau …). 

La multiplication à partir de la croissance de bourgeons axillaires offre les meilleures chances de conserver les caractéristiques de l’espèce ou de la variété. En effet, cette technique ne fait qu’accélérer le fonctionnement normal des méristèmes de bourgeons déjà présents sur la plante. Par contre, on diminue les chances d’une stabilité génétique en provoquant l’apparition de bourgeons nouveaux (la plupart du temps à partir d’un cal, en des endroits inhabituels tels les feuilles, les tiges, les racines). 

5.2.1.3.            Stade 3 : La multiplication des tiges  

 Cette étape s’effectue au repiquage des plantules obtenues au stade précédent. On veut ici accroître le nombre de plants d’un facteur de 4 à 5 à chaque cycle chez les ligneux, et d’un facteur de 4 à 12 chez les herbacées. Le milieu nutritif utilisé est souvent identique à celui du premier, bien qu’une différence parfois mineure s’observe dans la balance hormonale (équilibre auxine-cytokinine). Au stade de la multiplication, les cytokinines sont généralement présentes en plus grande concentration dans le milieu que les auxines. Ceci s’explique d’un point de vue physiologique par le fait que les cytokinines s’opposent à la dominance apicale donc stimulent la croissance de nouvelles tiges. Encore une fois, la littérature fournie généralement les informations nécessaires nous permettant de fixer notre choix sur une formulation appropriée. La vitesse de croissance des plantes in vitro se module à celle in situ. Si l’espèce mise en culture est à croissance lente, on peut s’attendre à observer une croissance lente dans les tubes.

5.2.1.4.            Stade 4 : La rhizogénèse (enracinement) 

 Cette étape se caractérise par la naissance de racines sur les tiges feuillées obtenues au stade de la multiplication. Il arrive parfois que des espèces présentent un système racinaire plus ou moins développé au stade de la multiplication. Dans ce cas, il serait avantageux de faire des essais pour le passage immédiat en acclimatation. On économise ainsi temps et argent s’il nous est possible de passer outre cette étape (ex. Bégonia, Saintpaulia, fougère). Toutefois, si ce stade s’avère nécessaire, le milieu de culture varie quelque peu des milieux précédents. Les sels minéraux et les vitamines demeurent généralement les mêmes. Mais dans le cas du rosier par exemple, on suggère de diminuer la concentration des sels minéraux de moitié. La différence majeure se situe principalement au niveau de l’équilibre hormonal qui se fera cette fois en faveur des auxines. Des tiges très feuillées et bien pourvues de bourgeons s’enracineront assez facilement dans un milieu dépourvu de régulateurs de croissance. Les jeunes feuilles et les bourgeons sont des sites naturels de production d’auxine et à l’image des boutures traditionnelles, ces jeunes plantules sauront s’enraciner d’elles-mêmes. Par contre, certaines espèces exigent l’apport d’auxines afin de stimuler l’initiation de leurs racines. Cet auxine est souvent fourni sous forme d’AIA.

5.2.1.5.            Stade 5 : L’acclimatation  

 Il s’agit de la dernière étape qui consiste à adapter progressivement les microplantules aux conditions qui prévalent dans la serre ou à l’extérieur. Après avoir éliminé la gélose de la base des plants, ils sont transférés dans un substrat horticole. Les parties aériennes sont ensuite recouvertes de manière à les maintenir dans un environnement qui avoisine les 100 % d’humidité relative. Les stomates de ces jeunes feuilles cultivées in vitro demeurent constamment ouverts et laissent donc s’échapper l’eau de transpiration de manière continue. Les risques de dessèchement sont très élevés. Aussi doit-on attendre la croissance de nouvelles feuilles fonctionnelles avant d’enlever progressivement la pellicule de recouvrement.

5.3.            Application de la culture in vitro : culture des méristèmes, culture de pollen

5.3.1.      Différenciation et dédifférenciation

5.3.1.1.            La différenciation

Les cellules d’un organisme proviennent toutes d’une même cellule-œuf ou zygote. Au cours de l’ontogenèse la mise en place des différents tissus implique la différenciation des cellules. Cette différenciation fait apparaitre une diversité qui se situe à plusieurs niveaux : niveau cytologique des structures et infrastructures cellulaires, niveau biochimique, niveau physiologique du fonctionnement.

5.3.1.2.            La dédifférenciation

 A l’inverse, des tissus déjà différenciés peuvent se dédifférencier c'est-à-dire recouvrer les caractéristiques cytologique et les potentialités des cellules embryonnaires.

Bien que les phénomènes de dédifférenciation puissent être observés chez les animaux, leur fréquence et leur importance chez les végétaux est à la base de la multiplication végétative, souvent conditionnée par la possibilité de néoformation des méristèmes.

Il est évident que la dédifférenciation ne peut affecter que des cellules qui ne sont pas trop engagées dans une spécialisation trop poussée.

La dédifférenciation peut être observée dans des conditions naturelles, lors de la formation de bourgeons et de racines adventives. La néoformation d’une ébauche de racine à partir de cellules péricycliques ou celle d’une ébauche de bourgeon à partir d’un fragment de feuille nécessite une dédifférenciation accompagnée d’une reprise de l’activité mitotique. 

5.3.2.      La culture des méristèmes 

Les plantes se développent grâce à des méristèmes, soit des petits groupes de cellules non différenciées qui se divisent. Dans le reste de la plantes, les cellules se différencient en fonction de leur situation: cellules de surface (épiderme), cellules de remplissage (parenchyme), cellules conductrices de la sève (Phloème, Xylème), … et cessent de se diviser

Ces méristèmes se trouvent dans les bourgeons, aux extrémités des racines et sur la longueur des tiges et des racines (méristèmes latéraux: ils induisent la croissance en épaisseur).

ü  Les bourgeons axillaires : ce sont les bourgeons situés à la base des feuilles.

ü  Le bourgeon terminal : il s'agit de celui situé au sommet de la plante.

ü  Les bourgeons adventifs : des cellules de la plante se dédifférencient et forment un nouveau méristème qui va développer un bourgeon (bourgeon adventif) puis une tige, ou une racine. Ces tiges ou racines sont alors appelées tiges ou racines adventives.( Figure ) 

La culture de méristèmes peut être considérée comme un microbouturage. Elle a été mise au point et utilisée pour la première fois par MOREL et MARTIN (1952, 1955) avec le Dahlia et la pomme de terre  pour la reconstitution de clones sains à partir de plantes infestées par des maladies à virus. Puisque elle utilise des points végétatifs préexistants, le seul problème d’organogenèse que pose (à première vue) la culture de méristème est la rhizogénèse. 

Cependant, à la suite des observations de MOREL (1960) sur les orchidées et de divers auteurs sur la possibilité de déclencher la prolifération des bourgeons axillaires à partir de l’apex cultivé initialement il est apparu que la culture de méristèmes (ou d’apex), outre son intérêt phytosanitaire, pouvait permettre la multiplication avec un taux très élevé.   

ü  La culture de méristème est une culture aseptique sur milieu artificiel du dôme apical sans ébauche foliaire. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de côté et la dissection se fait sous loupe binoculaire. La technique peut être associée à de la thermothérapie: culture à température élevée, pour favoriser l'élimination des virus. (Figure ) C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

ü  La culture de méristèmes permet le sauvetage des variétés menacées de disparition car très virosées. Elle concerne essentiellement les plantes à reproduction par voie végétative: bouturage, marcottage, etc. tels le Pelargonium, le dahlia, le chrysanthème, la pomme de terre, l'artichaut, le fraisier, framboisier, etc. car cette voie favorise la transmission des virus à la descendance.

Les plantes produites sont saines: sans virus, champignons et bactéries et répondent aux normes phytosanitaires d'échanges internationaux de plus en plus draconiennes.

Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et des qualités de floraison et de fructification restaurées.

On obtient des variétés conformes à la variété d'origine et que l'on peut multiplier en grande quantité, la production est homogène.

ü  Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues résistantes aux virus. Elles peuvent être recontaminées via des insectes si des mesures de prophylaxie ne sont pas prises. Pour certaines variétés qui présentent des chimères: plantes panachées de Petunia ou de Pelargonium par exemple, par culture de méristèmes il est possible de ne pas retrouver à la régénération ce caractère horticole. 

ü  De nombreuses variétés de diverses espèces ont été sauvegardées grâce à cette technique: pomme de terre (Belle de Fontenay en 1954), dahlias, fraisiers, vigne, iris, framboisiers etc.

Récemment la Violette de Toulouse a été sauvée du déclin grâce à la culture de méristèmes qui a permis de régénérer des plantes sans virus.

Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium, le chrysanthème etc. sont produites à partir de pieds mères qui ont été assainis par culture de méristèmes. Il en est de même pour des espèces maraîchères tel l'artichaut ou encore le fraisier.

5.3.2.1.            Régénération des vitroplants  

On comprend aisément que l'excision suivie de la culture in vitro des méristèmes aboutisse à la régénération de la plante. Selon l'espèce et les hormones utilisées dans Biotechnologies du clonage des génotypes, le méristème excisé donne des formations diverses : plantes, tiges, embryons, cals régénérants d'autres méristèmes, etc. 

Toutes ces structures produites par les méristèmes gardent une très forte potentialité de déroulement du programme de morphogenèse et sont généralement très fortement régénérantes. Ce sont donc des explants de choix pour produire des vitroplants, surtout dans les cas où un méristème excisé donne in vitro une structure développant de nombreux méristèmes adventifs, augmentant ainsi le pouvoir de multiplication de l'opération. 

Chaque ébauche mise en place par les méristèmes terminaux est pré-programmée pour son développement ultérieur (bourgeons végétatifs et bourgeons floraux chez un fruitier par exemple). 

La partie terminale de l'ébauche est stratifiée, elle aussi, en un méristème qui se mettra à fonctionner comme le méristème apical mais en prenant comme origine de programme génétique l'étape qui est inscrite dans ses cellules. On peut aussi in vitro cultiver ces méristèmes axillaires. S'ils sont très jeunes (sous l'angle du programme génétique), ils régénèrent des individus qui ont un développement sensiblement normal ; s'ils ont un âge génétique plus avancé, ils peuvent donner des régénérants déjà «âgés» (par exemple des pieds de tomate dont la floraison est ainsi hâtée, ce qui peut être intéressant). Mais il faut noter aussi que le milieu de culture in vitro constitue, en lui-même, un système de résonance avec l'explant et qu'il peut, par les hormones choisies, dédifférencier le tissu mis en culture,; c'està-dire décorréler le réseau épigénique et ainsi rajeunir le programme génétique. Un stade, se rapprochant du point zéro, est obtenu fréquemment en utilisant le 2-4 D qui déclenche la production d'une forte callogenèse. 

5.3.3.      La multiplication végétative (La micro-propagation)

 Elle permet de reproduire un individu et le multiplier en très grand nombre, à partir de cellules ou d’un fragment d’organe. Elle se réalise par exemple à partir de nœuds, de pousses axillaires et s’apparente au bouturage des jardiniers. Mis en culture, ces tissus se développent et donnent une plante entière grâce à l’usage séquentiel de milieux nutritifs adaptés. 

5.3.4.      La culture d’anthère et de pollen

Une plante haploïde est une plante dont le nombre de chromosomes est égal au nombre chromosomique des gamètes de la plante dont elle est issue. Les chromosomes de chaque paire n’y sont présents qu’à un seul exemplaire sauf quand il s’agit d’autopolypoïdes. De tailles plus réduite que le parent diploïde correspondant, L’haploïde est morphologiquement identique à celui-ci mais stérile. Ce n’est qu’après le doublement de son nombre chromosomique, lequel peut être spontané, inhérent au processus lui-même, que la fertilité est recouvrée et que la fixation de l’information génétique du génome haploïde par la duplication de celle-ci se produit. On obtient alors des haploïdes doublés lignées homozygotes pour l’ensemble de leurs gènes. Ce sont donc des lignées théoriquement parfaitement pures. Cette méthode, appelée « haplo-diploïdisation » permet donc d’accélérer la phase de fixation des produits de la recombinaison génétique issus d’un croisement.       

ü  C'est la régénération de plantes entières à partir de culture de cellules sexuelles mâles: des grains de pollen immatures, soit par culture de pollen isolé, soit par culture d'anthères.

ü   Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après doublement spontané ou artificiel par colchicine). Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans par technique classique d'autofécondations.

L'obtention de lignées pures est une étape presque toujours nécessaire des programmes d'amélioration des plantes.

ü  C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs, l'asperge, le piment, etc. et en routine chez le colza, l'orge et l'aubergine.

Le blé Florin a été la première variété issue d'androgenèse inscrite au catalogue français. Ce fut une première mondiale initiée par le laboratoire d'Amélioration des Plantes d'Orsay. Aujourd'hui de nombreux cultivars de diverses espèces et issus de ces techniques d'haplo-diploïdisation sont déposés chaque année.

ü  Cette technique amène un important gain de temps, ce qui permet de mettre plus rapidement sur le marché de nouvelles variétés présentant des avantages pour l'agriculteur, l'industriel ou le consommateur. En effet une plante homozygote  est directement obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de générations d'autofécondations pour obtenir une lignée pure, état nécessaire aux programmes de sélection végétale.

Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes, cela permet de dévoiler des caractères intéressants par l'expression des allèles récessifs  habituellement cachés. Ces gènes pouvant être exploités éventuellement.

Des recombinants intéressants peuvent ainsi être détectés et exploités, une résistance à une maladie par exemple.

ü  Le rendement, (nombre de plantes viables/100 anthères cultivées) est souvent dépendant du cultivar.

Certaines variétés de céréales produisent un grand nombre de plantes albinos, donc non viables. 

5.3.5.      L’obtention d’embryons somatiques

L’embryogénèse somatique est la production d’embryons à partir de cellules non germinales (par exemple cellules méristématiques) soumises à un traitement hormonal. Après cette induction, il se produit une multiplication des cellules suivie d’une différenciation progressive des embryons en culture.

5.3.6.      Le sauvetage des embryons

Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d’embryons consiste à prélever un embryon précocement, à le cultiver in vitro, soit pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu’il ne pourrait pas se développer dans les tissus maternels, par exemple lorsqu’il résulte d’un croisement interspécifique. 

5.3.7.      L’obtention de protoplastes

 Les protoplastes sont des cellules débarrassées de la paroi pectocellulosique par hydrolyse enzymatique. Ils peuvent être obtenus à partir de différents tissus d’une plante, de préférence des limbes de jeunes feuilles. Limités seulement par la membrane cytoplasmique, les protoplastes peuvent fusionner ce qui permet de créer de nouvelles variétés, d’introduire des caractères à hérédité cytoplasmique. Des plantes transgéniques peuvent être obtenues à partir de protoplastes transformés par électroporation., Cette méthode permet d’introduire de l’ADN nu (construction génique) dans les protoplastes par l’utilisation d’un champ électrique de haut voltage qui rend perméable leur membrane cytoplasmique.  L’ensemble de ces techniques permet de régénérer des plantes entières. (Figure) 

5.4.            Biotechnologie et amélioration des plantes

5.4.1.      L'amélioration des plantes  

II y a des centaines de milliers d'années, alors que l'un de nos ancêtres ramenait dans sa hutte des fruits pour les consommer en famille et laissait s'échapper des graines dans des détritus permettant une germination à proximité de l'habitation, l'amélioration des plantes était amorcée. Domestication inconsciente d'abord, jardinage ensuite, échanges, codification de l'agronomie, maîtrise des descendances renforcée par les premières lois génétiques, puis développement de l'amélioration des plantes en tant que science et éruption des biotechnologies. Et pourtant la création d'une nouvelle variété est-elle une véritable science ? Dessiner le profil d'un idéotype répondant mieux aux besoins de l'homme et de ses industries est aussi œuvre artistique, intuitive, sensible autant au confort de l'utilisateur qu'aux potentialités techniques du matériau. En revanche, c'est une science que de replacer l'objet rêvé dans le concret et de calculer la trajectoire la plus efficace et la plus économique pour aller du matériau-source jusqu'à cet idéotype. C'est dans ce compromis qui tient de la science et de l'art que se joue l'amélioration des plantes.

Les rendements de grandes productions telles que blé, betterave, maïs, colza, etc. ne cessent de progresser. On peut chiffrer statistiquement ce gain à 1% en moyenne chaque année. Bien sûr une bonne partie de ces augmentations doit revenir aux améliorations phytotechniques (engrais, traitements, machinisme).

Mais des estimations de sources diverses annoncent que la moitié des gains réalisés doit être attribuée au progrès génétique, qui se traduit par l'introduction de nouvelles variétés.

Si ces rendements sans cesse croissants ont parfois été obtenus au détriment de la qualité, cela ne constitue que quelques cas très particuliers. La standardisation des blés impose des normes de valeurs boulangères bien définies qui n'ont pas freiné les gains de production, les valeurs diététiques de l'huile de colza ont progressé en même temps que les rendements, les taux d'extraction des jus de betterave à sucre sont meilleurs et les rendements par hectare sont simultanément en augmentation, etc.

5.4.2.      La biotechnologie  

Est un terme relativement récent puisqu’il est apparu pour la première fois vers 1960. Il est composé de bios (« vie » en grec) et de technologie (entré dans la langue française en 1656, au sens « d’étude des outils, machines et matières premières ». Bien que son étymologie soit assez précise, sa définition est un peu plus vague, voire parfois subjective. L’utilisation d’organismes vivants et de leurs produits à des fins commerciales en est une définition large. Les premiers fabricants de vin et de pain peuvent donc être considérés comme des scientifiques en biotechnologie avant la lettre. Un sens plus restreint du terme « biotechnologie » l’associe aux réalisations des soixante dernières années comprenant toutes les techniques de culture in vitro, ainsi que les différents aspects de la génétique moléculaire, tels que le clonage de gènes, le séquençage et le génie génétique. De même, il existe deux définitions possibles du terme « biotechnologie végétale ». 

La première est une définition au sens large et traditionnel, selon laquelle la biotechnologie végétale est l’intervention humaine sur du matériel végétal au moyen d’instruments technologiques afin de produire des effets temporaires.

La seconde définition, au sens strict et moderne, décrit la biotechnologie végétale comme l’intervention humaine sur du matériel végétal au moyen d’instruments technologiques afin de produire des effets permanents (transmissibles à la descendance), incluant le génie génétique, ou manipulation génétique, pour obtenir des plantes transgéniques.

Le génie génétique végétal consiste à introduire de façon non naturelle de l’ADN externe dans un matériel végétal pour créer de nouveaux caractères héréditaires. On obtient ainsi des plantes génétiquement modifiées (PGM) ou plantes transgéniques.

 La biotechnologie végétale utilise une technique majeure, appelée « culture de tissus végétaux », associée à la culture in vitro de protoplastes, cellules, tissus et organes et qui consiste à cultiver des tissus ou des cellules en milieu totalement artificiel. Malheureusement, il est impossible de  contrôler entièrement tous les facteurs et de reproduire exactement les mêmes procédures in vitro. La culture de tissus végétaux implique les étapes suivantes :

ü  la croissance de matériel végétal exempt de microbes en milieu stérile (dans des tubes à essai ou autres récipients scellés). Toutes les précautions sont prises pour maintenir des conditions stériles strictes lors de la manipulation et de la culture du matériel végétal ; 

ü  l’utilisation de supports composés d’éléments connus et stériles car de nombreux composants organiques et inorganiques sont employés dans la culture in vitro de matériel végétal ;

ü  l’utilisation d’une chambre de croissance dans laquelle l’environnement (lumière et température) est contrôlé

5.4.3.      Les avantages de la culture in vitro 

5.4.3.1.            L’assainissement des végétaux

La culture in vitro permet l’élimination des virus et des bactéries. Exemple : le virus de la pomme de terre. 

5.4.3.2.            La multiplication de masse

Grace à cette technique, on peut obtenir rapidement et indépendamment des conditions climatiques, un grand nombre de plantes qui sont stockées dans un espace réduit.

5.4.3.3.            L'accroissement de la diversité

Des plantes rares, en voie de disparition, peuvent être conservées et multipliées en culture in vitro. De même, des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles à bouturer et/ou à greffer bénéficient aussi de cette technique. On peut ainsi obtenir des rosiers ou des vignes sur leurs propres racines.

5.4.3.4.            La multiplication de nouvelles espèces/variétés ou de plantes stériles:

ü  plantes résultant de croisement (hybrides) qui sont souvent stériles. - plantes transgéniques

ü  plantes à fruits sans pépin - plante présentant une caractéristique intéressante comme par exemple la couleur    particulière de ses fleurs ---> nouveau cultivar.

5.4.3.5.            La multiplication de plantes sélectionnées:

ü  Pour leur résistance aux maladies

ü  Pour leur production plus importante

ü  Pour leur tolérance à divers facteurs (sécheresse, excès d'eau, trop ou trop peu    de sels, froid/chaud, herbicide)

ü  Pour leur vigueur

5.4.3.6.            La sélection de plantes résistantes

On peut exercer une pression de sélection en cultivant les plantes sur des milieux contenant des concentrations croissantes en sels ou en herbicides. Les plus résistantes sont repiquées sur du milieu de plus en plus concentré. On peut, par la même technique, sélectionner des plantes capables de vivre sur des milieux pauvres ou des plantes résistantes à certains pathogènes.

5.4.4.      Fusion de protoplastes

Un des développements les plus significatifs de ces dernières années en matière de cultures de tissus végétaux est l’isolement, la culture et la fusion des protoplastes. 

Le terme protoplaste désigne la partie de la cellule qui se trouve entourée par la paroi cellulaire et que l’on peut plasmolyser  et isoler par de moyens mécaniques ou enzymatiques. L’absence de paroi cellulaire dans les protoplastes est le motif essentiel de leur emploi comme modèle et outil de travail en physiologie végétale, radiobiologie, virologie et pathologie, cytogénétique, biochimie, biologie moléculaire, génétique et amélioration des plantes.

Cet important domaine de recherche n’a prospéré qu’à partie de 1960 lorsque Cocking mis au point la méthode d’obtention des protoplastes par la voie enzymatique. Depuis cette date de nombreux articles ont été publiés.

5.4.4.1.            Hybridation somatique 

La reproduction sexuée est l'un des mécanismes les plus stricts que les processus évolutifs ont mis en place pour empêcher les flux génétiques entre les espèces. Bien plus, à l'intérieur de l'espèce elle-même, des frontières très précises permettent tel ou tel type d'accouplement autorisant ou non l'allogamie ou l'autogamie et définissant par là même la structure génétique plus ou moins hétérozygote du génotype. La méiose en elle-même impliquant l'appariement des chromosomes homologues élimine tout remaniement profond des chromosomes et contrôle ainsi l'homogénéité de l'espèce. Les biologistes ont constaté, au cours des manipulations cellulaires, que l'on pouvait obtenir des agrégations entre des cellules débarrassées de leur paroi pecto-cellulosique et qu'il en résultait une fusion des éléments nucléaires et cytoplasmiques ; le principe même de l'hybridation somatique était né. Melchers montra ensuite que cette fusion était possible entre des protoplastes différents (tomate et pomme de terre), indiquant ainsi que l'on pouvait transgresser les frontières de l'hybridation sexuée. 

5.4.4.2.            Étapes importantes de l'hybridation somatique

ü  Les protoplastes 

Dans la cellule végétale, la membrane plasmatique ou plasmalemme est doublée par une paroi squelettique constituée de fibres de cellulose et de pectine. La cellule exerce une pression sur ces fibres à la manière d'une chambre à air sur un pneu. Ainsi les plantes herbacées ont une certaine rigidité due à leur tonicité. Bien que l'état protoplaste ait été connu depuis le début du siècle, ce n'est que vers les années 1960 que Cocking montrait que, par des enzymes du type cellulase et pectinase, on pouvait attaquer les fibres pecto-cellulosiques et dissocier les tissus végétaux, mettant ainsi à nu la membrane plasmatique de chaque cellule. Divers explants sont utilisables : feuilles, cotylédons, hypocotyles. Il est également possible de partir de matériel déjà dédifférencié : cals ou suspensions cellulaires. L'accès de l'enzyme aux tissus est facilité, selon le cas, par dilacération des explants ou infiltration sous vide. Pour le mésophylle foliaire, la technique classique consiste à ôter l'épiderme inférieur. Malgré la diversité des origines possibles, le mésophylle foliaire reste la source de protoplastes la plus utilisée. En effet, cet explant est généralement disponible en grande quantité, son prélèvement ne lèse pas trop la plante et le matériel produit est abondant et homogène. Les explants préparés sont alors incubés dans la solution enzymatique, dans de très strictes conditions de durée, de température, d'éclairement et de pression osmotique. Chaque unité cellulaire dénudée apparaît alors sous une forme sphérique appelée protoplaste. Chez la luzerne, on obtient ainsi environ 12.106 protoplastes par gramme de feuille traité. Les protoplastes, récupérés par centrifugations et lavages, et mis dans de bonnes conditions de survie, reconstituent très vite leur paroi pecto-cellulosique (en quelques heures on voit apparaître les premières fibres). Ensuite, si les conditions de milieu sont toujours favorables, les protoplastes entrent en mitose et donnent ainsi des microcolonies qui deviennent des microcals, puis des cals. Les premières divisions apparaissent entre le 3e et le 5e jour de culture. Outre la nature du milieu, la densité de mise en culture joue un rôle important pour l'obtention d'un taux de divisions correct (30 à 80 000 protoplastes par ml, et généralement plus pour les monocotylédones).

Les petites colonies sont visibles, à l'œil nu, après une quarantaine de jours. La totipotence peut être maintenue dans ces cals issues de protoplastes et s'exprime dans un milieu de régénération approprié où le cal donne des formations méristématiques qui se développent en jeunes plantes, ou, dans des cas plus favorables, en embryons somatiques qui donneront des plantules. Chez certaines espèces, dont le nombre s'accroît sans cesse, on sait donc boucler le cycle plante — protoplastes — plantes.

 Les pourcentages de régénération de plantes sont généralement  faibles, comparés au très grand nombre de protoplastes obtenus dans une opération : ils sont le produit de l'efficacité d'étalement (probabilité pour un protoplaste de donner un cal) par le nombre moyen de plantes régénérées par cal (fréquence de régénération). Même dans de bonnes conditions opératoires et avec un matériel végétal favorable, le cycle plante — protoplastes — jeunes plantes est relativement long (quelques mois). 

ü  La fusion 

 On appelle «fusion» l'agrégation de deux, ou plusieurs, protoplastes. L'intérêt du passage de la cellule isolée par le stade protoplaste réside dans l'accessibilité de cette dernière structure. Généralement, les protoplastes se repoussent à cause de leurs charges électrostatiques négatives. Cette charge est due en majorité aux groupes phosphates et pour une part plus faible à des protéines. L'accolement des protoplastes, étape préalable indispensable pour la fusion, doit donc être provoquée par l'expérimentateur.

 Des agents chimiques, comme le calcium ou des substances «surface-actives» non ionisées, comme le polyethylene glycol (PEG), sont dans ce but assez efficace. Une fois les protoplastes accolés, la dilution de ces substances induit des perturbations membranaires provoquant alors la fusion. Les taux de fusion ainsi obtenus varient entre 0% et 5% environ. Mais, depuis ces dernières années, on a pu faciliter l'agrégation des protoplastes en pratiquant l'électrofusion. Cette technique consiste à placer sur la solution de protoplastes dans la boîte de Pétri un système multi-électrodes (14 électrodes écartées de 2 mm) relié à un générateur de courant sinusoïdal de haute fréquence couplé avec un second générateur d'impulsion de courant carré. Lorsqu'on applique le champ électrique (125 V/cm, 1MHz) induit par le courant sinusoïdal, les protoplastes se comportent comme des dipôles et s'alignent en suivant les lignes de champs, assurant ainsi leur contact intime. La fusion a alors lieu dans un deuxième temps où l'on envoie des impulsions très courtes (20 à 30) d'un courant carré de 1,3 KV/cm. La fusion peut être observée sous microscope inversé, donnant une estimation des taux de fusion réalisés. La suspension des protoplastes fusionnés est alors reprise par dilution progressive dans un milieu de culture, comme pour les fusions provoquées par voie chimique. Cette technique permet d'obtenir des taux de fusion de l'ordre de 80%. La fusion se produit d'une manière aléatoire, due aux relations de voisinage des protoplastes et à la neutralisation de leurs charges ; leur volume intervient donc vraisemblablement. Si le mélange contient en quantité égale deux espèces différentes A et B et si l'on admet, de manière théorique, que les divers types de fusion sont équiprobables, on doit observer : un quart d'autofusions AA, une moitié d'hétérofusions AB et un quart d'autofusions BB (dans cette estimation nous ne tenons pas compte des fusions multiples, qui en général sont assez rares, ni des fusions partielles). Lors de l'accolement de deux protoplastes, l'ensemble du contenu cellulaire est mis en commun : on peut donc aboutir à l'addition totale des trois compartiments héréditaires : nucléaire, mitochondrial et chloroplastique. Cette addition totale accroît le niveau de ploïdie de l'unité résultante. Mais deux phénomènes viennent perturber le déroulement sans accident de l'agrégation :

ü  d'une part, les échanges ne sont pas toujours totaux : on peut aboutir à une addition incomplète et à un microplaste résiduel ; 

ü  dès la fusion réalisée, des compétitions et des éliminations se mettent en place. Par exemple, à chaque mitose subséquente il se peut que certaines paires chromosomiques soient rejetées et ne participent plus aux noyaux télophasiques. Cette éviction chromosomique peut aller jusqu'à l'élimination totale de l'un des deux noyaux parentaux.

Pour le compartiment mitochondrial, les phénomènes sont encore plus complexes, car ils comportent des compétitions entre les vitesses de réplication et des auto- et hétérorecombinaisons en des sites privilégiés. On peut donc trouver des populations contenant tous les dosages intermédiaires entre l'addition totale et l'absence de l'un des types. Chez les chloroplastes, les règles paraissent plus strictes puisque généralement l'un des types parentaux élimine totalement l'autre : il ne subsiste donc qu'une seule population d'ADN chloroplastique. Lorsque les noyaux se sont additionnés partiellement ou en totalité, on parle d'hybride somatique ; s'il ne subsiste que l'un des noyaux parentaux avec un cytoplasme composite et/ou recombiné, on parle de «cybrides» (cytoplasme hybride). Bien qu'il apparaisse des formes majoritaires, on voit bien qu'une même opération de fusion produit tout un spectre de structures génétiques entre lesquelles il est parfois difficile de se retrouver.

5.4.5.      Haplo-méthodes (Androgenèse et gynogenèse)

Les haploïdes ont toujours suscité un très vif  intérêt des sélectionneurs, pour la claire lisibilité de leur génome, mais surtout parce qu'ils sont la source d'homozygotes parfaits puisqu'on sait autodoubler leur stock haploïde de chromosomes. Depuis longtemps on est capable d'obtenir des plantes haploïdes à très faible fréquence à la suite de polyembryonie ou plus simplement de graines à embryons doubles. On sait aussi obtenir des descendances haploïdes à partir d'hybridations interspécifiques suivies de cultures in vitro des jeunes embryons ainsi induits. Mais il y a une trentaine d'années, pour la première fois étaient régénérées des plantes à partir de culture in vitro de microspores ayant donc un stock haploïde de chromosomes chez le tabac. Cette voie d'obtention volontaire de plantes haploïdes s'est vite étendue à d'autres espèces, puis on a diversifié les méthodes. A l'androgenèse (régénération de plantes in vitro à partir de culture de microspores) s'est ajoutée la gynogenèse obtenue à la suite de culture d'ovules non fécondés ; puis, plus récemment, des apomixies provoquées par irradiations, soit du gamétophyte mâle, soit du gamétophyte femelle, ont aussi été sources d'individus haploïdes.

5.4.5.1.            Les haploïdes doublés 

 Les plantes obtenues par les diverses techniques sont issues, en principe, d'une cellule haploïde : ce sont donc en fait des «plantes sans mère» (androgenèse) ou des «plantes sans père» (gynogenèse). Cependant, dans de nombreux cas, l'individu régénéré est diploïde ou même parfois polyploïde (pétunia, asperge, par exemple) ; c'est que l'état haploïde est instable et que lors des mitoses haploïdes la télophase ne se déroule pas normalement. On a donc une endomitose et un retour à l'état 2n. De toute manière, la plante haploïde est stérile dans la majorité des cas où l'individu de départ était un véritable diploïde (lorsque l'individu de départ est tétraploïde, on appelle «dihaploïde» la structure 2n = 2x obtenue après haploïdisation). Utilisation des haploïdes doublés Pour utiliser une plante régénérée par l'une quelconque des voies d'haploïdisation, il faut donc la rendre fertile et provoquer artificiellement un doublement des chromosomes si celui-ci n'a pas été spontané. Par des traitements qui inhibent l'alignement des microtubules du fuseau, on provoque des endomitoses qui rétablissent le niveau diploïde. La colchicine est l'un des agents les plus couramment employés pour obtenir cette autocopie du stock haploïde. On récupère donc chez ces haploïdes doublés une homozygotie totale. De telles plantes fertiles, diploïdes et homozygotes reproduites par autofécondation donnent des descendants tous parfaitement semblables à la plante mère ; on a «fixé» le type sous la forme d'une lignée pure.

Pour un sélectionneur partant d'une hybridation, l'haploïdisation dès la F1 donne, sous forme d'individus régénérés tous différents les uns des autres, l'expression visuelle d'une ségrégation gamétique. Avec le doublement des chromosomes, on rend fertiles Haploïdisation et stables ces nouveaux génotypes parmi lesquels il suffit de choisir ceux qui sont les plus proches de l'idéotype. 

L’haplodiploïdisation intéresse aussi les sélectionneurs et les généticiens plus fondamentaux. Actuellement, des progrès dans la compréhension du déterminisme génétique de caractères de grande importance agronomique viennent de l’utilisation conjointe des haplométhodes et du marquage moléculaire (orge, maïs, piment). Les principales limitations de l’’haplodiploïdisation restent la difficulté et le coût de l’obtention des plantes haploïdes doublées. De plus, certains sélectionneurs considèrent que le temps nécessaire pour fixer la lignée lors de la sélection généalogique leur donne l’opportunité de mieux connaître les réactions de la future variété vis à vis des stress. 

5.4.6.      Variations soma-clonales

Vitrovariants

Lorsque les éléments excisés sur la plante donneuse perdent les repérages apportés par les réseaux de signaux ou sont incapables, du fait du milieu de culture et notamment de l'utilisation du 2-4 D, de les restructurer, des réactions épigéniques différentes gèrent un déroulement modifié du programme génétique. Par ailleurs, les systèmes de sauvegarde de l'intégrité génotypique sont relâchés, la réparation des mutations, l'excision des erreurs de mitose, les contrôles du nombre de chromosomes liés aux mécanismes d'endoduplication sont affaiblis. Il apparaît alors des copies non conformes (morphologiquement ou physiologiquement) qu'on désigne sous le terme de phénovariants ou vitrovariants. Cette découverte française a été diffusée par les Anglo-Saxons sous l'appellation «variation somaclonale», mais le terme vitrovariations est plus correct.

5.4.6.1.            Variation soma-clonale et sélection in vitro

Chez de nombreuses espèces, des modifications temporaires ou stables ont été décrites dans les lignées de cellules en culture, ainsi que dans les plantes régénérées à partir de ces cellules. L'ampleur de cette variation somaclonale diffère beaucoup suivant les espèces : elle est remarquable chez le riz. L'utilité des mutations induites par la culture in vitro peut être accrue si une sélection est exercée au niveau des cellules, de manière à réduire le nombre de plantes à tester en laboratoire et au champ après régénération. 

5.4.7.      Embryogenèse somatique

La formation d’embryon à partir de cellules somatiques normales a été obtenue en culture in vitro chez la carotte par REINERT (1958) et STEWARD et coll. (1958) puis chez un certain nombre d’espèces appartenant à des familles très diverses.

La formation d’un embryon ne peut donc plus être considérée comme l’apanage du zygote issu de la fécondation. Elle ne nécessite pas non plus l’environnement particulier que constitue l’albumen. Les embryons peuvent se développer à partir de cellules apparemment banales, diploïdes ou même haploïdes dans le cas de (l’androgenèse). 

Cependant, il arrive souvent, qu’on ne sache pas très bien si les plantules régénérées proviennent de véritables embryons somatiques (ou embryoïdes) ou du développement successif d’un bourgeon et de racines.

En effet, après quelques temps, les deux types de productions ne peuvent plus être distingués. Mais l’embryoide suit le même développement qu’un embryon normal en passant par les étapes décrite  par l’embryogenèse 

Le fait qu’un embryon ne soit pas nécessairement le produit de la fécondation a une portée biologique et fondamentale considérable. L’embryogenèse somatique a illustré le concept de la « totipotence cellulaire ». Toute cellule possède en effet dans son génome l’information nécessaire pour reconstituer une plante entière. Mais il semble bien qu’elle ne puisse le faire effectivement qu’à condition de n’être pas engagée trop loin dans le mécanisme de la différenciation et d’être placée dans un environnement approprié.

L’embryogenèse somatique parait être la méthode théorique « idéale » de multiplication végétative. Elle devrait en particulier permettre d’utiliser, dans l’avenir, les résultats éventuels de manipulation au niveau cellulaire (mutagenèse, fusion de protoplastes….).    

Deux types d’embryogenèse somatique :

Directe : s’effectue directement à partir de cellules très jeunes embryogènes.

Indirecte : On obtient un amas de cellules indifférenciées. De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoquées à partir des tissus cultivés grâce à l’apport d’une forte dose d’auxine : un cal.

5.4.8.      Sauvetage d’embryon

Sauvetage d’embryons par culture in vitro qui autrement avorteraient sur la plante mère, en particulier dans le cas de croisements entre espèces. Ceci a permis par exemple l'obtention des triticales, obtenus par croisement du blé et du seigle, largement cultivés aujourd’hui notamment en agriculture biologique, ou encore l’introduction de résistances à des maladies chez la to- mate à partir d’espèces sauvages.   

5.4.9.      Transfert de gènes

Les développements des connaissances sur le code génétique et la régulation de son expression par les zones voisines du gène sur le chromosome et surtout la découverte d'enzymes, les endonucléases de restriction, qui découpent avec précision la molécule d'ADN ont ouvert des perspectives incommensurables au génie génétique. On peut dès maintenant extraire, après repérage, un gène de l'ensemble du domaine vivant (du virus, de la bactérie, jusqu'à l'homme) et le transférer sur les chromosomes de la plante qui, à partir de là, le transmettra à ses descendants au même titre que ses propres gènes. Nous en sommes aux toutes premières réussites de l'expérimentation par les sélectionneurs de telles plantes dites transgéniques, mais on peut prédire que les prochaines décennies exploiteront, en routine, cette très puissante technologie. Pour l'instant, l'utilisation de résistances monofactorielles à des molécules insecticides ou herbicides représente le champ d'application de ces transferts moléculaires.

Mais déjà on se préoccupe de la manipulation non seulement de l'ADN codant, mais aussi des produits de transcription (ARN messagers) ou de traduction (polypeptides) du gène. Ici encore, des attaques post-transcriptionnelles, par voie moléculaire, vont révolutionner les champs d'application du génie génétique.

Comme on le constate, le sélectionneur peut, par de nombreuses voies, introduire une diversité génétique dans les génotypes qu'il a extraits des populations sources ou des collections variétales disponibles. Dans tous les cas, cette diversité constitue, par les ségrégations et les remaniements d'expression qu'elle entraîne, un champ de sélection dans lequel il faut individualiser et modeler le futur prototype d'une variété nouvelle.

  

Reference Bibliographique

Chaib Ghania,…., Introduction à la biotechnologie L3

Guettouchi Ahlam, 2019, Cours  Biotechnologie végétale et amélioration des plantes. République Algérienne Démocratique et Populaire.  Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Mohamed Boudiaf- M’Sila . 46p          

Margara J. Bases de la multiplication végétative : Les méristèmes et l’organogenèse. Ed.INRA, 1982, Paris, France.

 - Morot-Gaudry J.-F., Briat J.-F. La génomique en Biologie Végétale. Sciences Update.INRA Editions.

- Le Monde végétal : Du génome à la plante entière. Académie des Sciences rst n°10,octobre 2000. Editions TEC et DOC